20250217-20250223

• 上午组会
• cck8测得K562细胞48hr

• 计算作图
• SET-2cck8给药LPH-95；LPH-50，测48hr

• 2.20测得结果

• NP小论文作图，查重后降重

• 完成FIG.1

• 测得K562的LPH-95在72hr的cck8

• 后续需计算并作图

• 质粒放到四度冰箱，下午16点继续放到100ml体系里扩增
• 沈老师组样品清单交接
• NP小论文作图
• set-2细胞铺板*5，HEL细胞传代，K562细胞继续培养
• cck8测得结果

• 配置母液

1. 从100 mM母液稀释到50 µM

• 目标浓度：50 µM
• 母液浓度：100 mM = 10mM
• 目标体积：2.4 mL

• 取1.2 µL的100 mM母液，加入2398.8 µL的稀释液（如生理盐水），得到2.4 mL的50 µM溶液。

2. 从50 µM稀释到5 µM

• 目标浓度：5 µM
• 母液浓度：50 µM
• 目标体积：2.4 mL

• 取240 µL的50 µM溶液，加入2160 µL的稀释液，得到2.4 mL的5 µM溶液。

3. 从5 µM稀释到0.5 µM

• 目标浓度：0.5 µM
• 母液浓度：5 µM
• 目标体积：2.4 mL

• 取240 µL的5 µM溶液，加入2160 µL的稀释液，得到2.4 mL的0.5 µM溶液。

最终方案

• 50 µM溶液：
  • 取1.2 µL的100 mM母液 + 2398.8 µL稀释液 → 2.4 mL的50 µM溶液
• 5 µM溶液：
  • 取240 µL的50 µM溶液 + 2160 µL稀释液 → 2.4 mL的5 µM溶液
• 0.5 µM溶液：
  • 取240 µL的5 µM溶液 + 2160 µL稀释液 → 2.4 mL的0.5 µM溶液

• 细胞冻存：细胞放坏了，直接扔掉

• 细胞传代 HEL SET-2 K562 A549 H23 H1299
• 纯化蛋白-诱导表达

• 复苏UKE1悬浮细胞（天津寄出）
• 回复审稿意见
• 蛋白质纯化：离心-超声裂解-过夜过柱

• 处理细胞：HEL传代，K562传代，SET-2继续培养
• 蛋白质纯化：
• 用5ml预冷的 wash buffer( 50 mMNH PO300 mMNaC1 20 mM imidazole、1mMPMSF， pH8.0) 洗涤 N-NTA 柱填充物·1000 rpm,5min/次，除去非特异结合的蛋白。反复洗8-9次。
• NANO2000 测A280，直至吸光度接近0。
• 用预冷的Elution buffer(50 mM NaH PO:300 mMNaC1 250 mM imidazole 1 mM PMSF，30%甘油，5mMDTTpH8.0)。5m/次，洗4-6次，直至蛋白检测液变浅。
• 标注好洗脱次数(E1,E2或E3)，液氮中速冻后存于-80℃。
• 采用 SDS-PAGE的方法鉴定重组蛋白的大小。
• 在N-NTA梯度洗脱组分即纯化后的重组蛋白加入同等体积的2xSDS凝胶加样缓冲液(100 mM Tris-HCI (pH6.8),200 mM DTL.4% SDS,20%甘油2mM钒酸钠，0.2%溴酚蓝)，在沸水浴中加热10min后，于4℃ 12000xg离心10分钟.取上清液进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE胶的浓度为10%。
• 电泳结束后，加入考马斯亮蓝R-250染色，观察蛋白茶带，与Marker对照。