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由于SARS-CoV-2变异株不断出现以及SARS-CoV-2感染带来的后遗症，SARS-CoV-2仍是全球持续关注的健康问题。化湿败毒汤是经批准的SARS-CoV-2治疗方剂，在临床上被证明具有广泛的疗效，但其抗病毒机制尚不清楚。本文，我们整合了网络药理学、深度学习靶点预测、基于配体的相似性分析、多构象虚拟筛选、酶抑制试验和分子动力学模拟，从HSBD作用于宿主和病毒靶点两个角度探索其治疗机制。网络药理学分析结果表明，HSBD中的多个成分与宿主蛋白TP53、HSP90AA1、STAT3、MCL1、EGFR和GSK3B等结合，调节PI3K-Akt和MAPK等信号通路，从而抑制病毒复制和炎症。同时，深度学习和基于配体的方法将SARS-CoV-2 Mpro和PLpro识别为病毒靶标，并通过多构象分子对接，筛选出200种潜在的bioactive compounds。Considering both structural diversity and commercial availability, 11 compounds were ultimately purchased for experimental evaluation. 酶活抑制实验结果证实，Licoflavone B）可抑制PLpro，Glabrol可抑制Mpro，Isobavachalcone可发挥M^pro/PL^pro双重抑制作用，分子动力学分析显示Gln110（M^pro）和Tyr268（PL^pro）是关键的结合残基。

HSBD exert its therapeutic effects against SARS‑CoV‑2 through multiple components, multiple targets and multiple pathways. 我们通过计算模拟结合实验验证，确证了有效成分underlying the anti-SARS-CoV-2 effects of HSBD，并通过分子动力学模拟进行了分子机制探索。

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GA 患病率的上升给社会和家庭带来了沉重的负担 (Cross et al., 2024; Safiri et al., 2020)，凸显了对有效治疗的迫切需求。中医药因其在治疗和预防包括 GA 在内的各种疾病中的作用而引起了全球的关注。QSXZ 源自经典中医方剂四妙丸，常用于治疗高尿酸血症和 GA (Lin et al., 2020; Zeng et al., 2024; Zhang et al., 2023b)。先前的研究表明 QSXZ 在治疗痛风方面具有临床疗效 (Li et al., 2019)；然而，其活性化合物和关键靶点仍然很大程度上未被发现。本研究结果表明，QSXZ及其药效成分CTS能够靶向S100A8/A9，抑制NLRP3-IL-1β介导的炎症，提示QSXZ和CTS可能是一种安全有效的痛风治疗方案。

本研究使用密歇根州立大学（MSU）诱发的急性痛风性关节炎和MSU诱发的皮下气囊小鼠模型进行了深入研究。QSXZ及其成分CTS在这些模型中表现出良好的疗效。在MSU诱发的急性痛风性关节炎模型中，QSXZ不仅减轻了踝关节肿胀，还抑制了促炎细胞因子的分泌和炎症细胞的浸润，这与观察到的临床疗效一致（Li et al., 2019）。鉴于中性粒细胞在痛风炎症中的关键作用（Mitroulis 等人，2013；Renaudin 等人，2020），我们皮下气囊模型的数据显示，QSXZ 可以抑制中性粒细胞的趋化作用。值得注意的是，CTS 在痛风性关节炎和皮下气囊模型中均表现出与 QSXZ 相似的抗炎作用，表明 CTS 是 QSXZ 的重要活性成分，在治疗痛风性关节炎 (GA) 方面具有强大的抗炎特性。

由于中药成分极其复杂，其药效动力学机制长期以来一直困扰着研究人员。2007 年提出的“网络药理学”概念（Hopkins，2007）与中药的多靶点和多途径特性密切相关。这一概念已引起广泛关注，并成为中医药研究领域的前沿和热门话题（Gan 等，2023；Zhang 等，2023a；Zhou 等，2024）。为了应对这一艰巨的挑战，我们提出了一种多模态研究策略来鉴定痛风消瘀方的有效成分。该策略协同整合了多种生物和化学技术以及不同的模型系统。通过利用基于 UPLC/MS/MS 的网络药理学进行无偏分析，我们鉴定了痛风消瘀方中的 49 种成分。这些成分与几个核心靶点相关，包括 TLR4、TNF、IL-6、IL-1B 以及与痛风消瘀方和痛风相关的众多炎症相关通路。我们的初步研究表明，痛风消瘀方通过多个靶点和通路抑制痛风炎症，这与其他中医药研究的多面机制特征相一致。

为了进一步阐明QSXZ的特定靶点，我们进行了转录组分析。结果显示，QSXZ治疗导致某些基因的表达发生改变，包括S100A8和S100A9。已知这两个基因通过形成称为S100A8/A9的异二聚体复合物发挥其生物学功能(Wang et al., 2018)。该复合物主要通过S100A9与下游受体结合，在各种细胞过程中发挥关键作用(Liu et al., 2022; Sreejit et al., 2020)。值得注意的是，S100A8/A9由中性粒细胞和单核细胞分泌，并在炎症反应中发挥关键作用(Jakobsson et al., 2023; Wu et al., 2023; Zhang et al., 2023c)。我们的研究还发现，与健康对照组相比，痛风患者单核细胞中 S100A8 和 S100A9 的表达增加。此外，ELISA 结果证实痛风患者血清中 S100A8/A9 的水平更高。这些发现强烈表明它们参与了痛风相关的炎症。已有充分证据表明，S100A8/A9 异二聚体普遍存在，并且能够激活 NLRP3 炎症小体通路。这种激活，尤其是在由警报素触发时，在全身炎症中起着至关重要的作用。此外，S100A8 和 S100A9 可以激活模式识别受体 TLR4 (Kovačić et al., 2018; Zheng et al., 2022)，从而诱导无菌炎症信号。髓系细胞和中性粒细胞中TLR4的上调进一步支持了S100A8/9-TLR4相互作用介导的过度炎症反应，最终导致NLRP3炎症小体的激活和随后IL-1β的分泌(Cho et al., 2024; Fang et al., 2023; Ma et al., 2017)。靶向NF-κB信号通路是利用天然产物调节炎症反应的一种有效策略。特有植物的成分可以抑制NF-κB通路，这对于发现抗炎物质至关重要(Notarte et al., 2017)。

鉴于SARS-CoV-2在持续性感染中进化的随机性（引文:The consequences of SARS-CoV-2 within-host persistence | Nature Reviews Microbiology）与其带来的诸多后遗症（引文：SARS-CoV-2 epidemiology, kinetics, and evolution: A narrative review - PMC）等原因，SARS-CoV-2 已成为一场具有长期影响的新流行病，持续危害着人们的生命健康和生活质量，寻找安全可靠，可防治新冠的治疗方法是临床上的迫切需求。中医药在防治新冠方面的作用引起了全球的关注。HSBD作为“三药三方”之一，其临床疗效被广泛认可（引文）。然而，其活性化合物，关键靶点，治疗新冠的机制仍未完全阐明。本研究结果表明，从复方整体作用于宿主靶点的角度，HSBD可通过作用于PI3K-Akt signaling pathway等通路发挥抗新冠作用；此外，从作用于病毒靶点的角度，其药效成分Licoflavone B，IsobavachroMene，GLABROL能够靶向sars-cov-2 mpro和plpro,发挥抗病毒作用。

中药复方成分的复杂性为其作用机制阐明带来了极大困难，网络药理学可以有效研究中药的多成分多靶点治疗机制（引文），已成为阐明中医药治疗机制的有效手段。本研究中，我们通过网络药理学分析，表明HSBD中成分与TP53, HSP90AA1, STAT3,MCL1, EGFR, GSK3B在内的多个核心靶点相关并作用于PI3K-Akt signaling pathway，MAPK signaling pathway等信号通路，通过抑制病毒复制，减轻炎症反应等机制发挥抗新冠作用。已有研究报道HSBD可调控PI3K/Akt的表达，这与我们的网络药理学分析结果一致。notebly，HSBD对急性肾损伤的保护作用已被报道（引文）且SARS-CoV-2感染导致的STAT3信号异常是COVID-19患者肾损伤的潜在病理机制之一（引文）。这其中的联系可能可以通过我们的PPI网络分析结果所解释：STAT3被identified为HSBD抗新冠的的关键靶点之一。该结果展示了HSBD作为一种被临床证实的安全有效（引文）的中药复方，缓解病毒感染后并发症并减少治疗相关不良事件的潜力。

由于网络药理学分析中涉及的靶点主要为人源靶点，缺少病毒相关靶点。因此我们基于抗sars-cov-2药物靶标预测与虚拟筛选综合平台D3Targets-2019-nCoV，结合生物实验与分子动力学模拟，确证了3个源自HSBD的抗病毒活性成分并分析了其与靶标的结合模式。结果表明，源自HSBD中的活性成分Licoflavone B（TCMID-15972）是sars-cov-2 plpro的抑制剂，GLABROL（TCMID-27476）是sars-cov-2 mpro的抑制剂，IsobavachroMene（TCMID-27300）是dual inhibitor of SARS-CoV-2 Mpro and PLpro。SARS-CoV-2 Mpro and PLpro是SARS-CoV-2 基因组中的两种主要蛋白酶，在病毒复制中起着关键作用且被报道与sars-cov-2的免疫逃逸密切相关（引文）。本研究中的分子动力学模拟结果表明3个活性成分与其靶标均存在稳定的结合。通过统计模拟过程中的高接触频率氨基酸以及残基能量分解分析，GLN110被鉴定为GLABROL，IsobavachroMene与SARS-CoV-2 Mpro结合的关键氨基酸，TYR268被鉴定为Licoflavone B，IsobavachroMene与SARS-CoV-2 PLpro结合的关键氨基酸。

综上所述，我们通过网络药理学分析，靶标预测，活性化合物筛选，生物实验验证，分子动力学模拟的组合方法，从宿主和病毒两个角度研究了HSBD的抗新冠作用。鉴定出具有抗病毒活性的生物活性化合物，为抗sars-cov-2药物的开发提供了候选化合物。